寡核苷酸是合成的短鏈DNA或RNA分子,可用于治療,通過與目標基因或蛋白序列結(jié)合來阻礙基因表達或蛋白發(fā)揮作用??焖僭鲩L的寡核苷酸療法市場包括靶向性非常強的反義DNA和小干擾RNA (siRNA),在治療癌癥、遺傳病和其他疾病方面有著廣泛的應(yīng)用前景。
液相色譜技術(shù)具有分離效率高、選擇性好、檢測靈敏度高、應(yīng)用范圍廣等特點,已成為核酸藥物生產(chǎn)與質(zhì)控分析必不可少的重要手段。本期內(nèi)容將介紹TSKgel色譜柱在寡核苷酸分析中的應(yīng)用。
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治療性寡核苷酸分離色譜模式如下圖:
一、離子交換色譜柱
TSKgel DNA-NPR陰離子交換色譜柱性能參數(shù)。
基質(zhì) | 聚甲基丙烯酸酯 |
粒徑 | 2.5μm |
孔徑 | 無孔 |
官能團 | 獨有 |
抗衡離子 | ClO4- |
pH耐受范圍 | 2.0-12.0 |
蛋白容量 | 5g BSA/L |
離子交換容量 | 0.1eq/L |
pKa | 11.2 |
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下圖是TSKgel DNA-NPR陰離子交換色譜柱對13個堿基的硫代磷酸寡核苷酸粗樣分析的色譜圖。
色譜條件:
色譜柱:TSKgel DNA-NPR(4.6×75mm)
流動相:A:20mmol/L NaOH(pH 12)+10mmol/L NaBr+1%二乙胺
????B:20mmol/L NaOH(pH 12)+1mol/L NaBr+1%二乙胺
梯度:3.5min(20%B),12min(20%B),45min(55%B)
流速:1.0ml/min
檢測:UV260nm
溫度:60℃
樣品:粗合成寡核苷酸(13mer,脫保護)
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一、尺寸排阻色譜柱
硅膠基質(zhì)填料表面鍵合二醇基,粒徑2μm,適用于小分子蛋白、多肽、寡核苷酸等生物分子的快速、高分辨率分析??杉嫒?/span>UHPLC系統(tǒng)與常規(guī)HPLC系統(tǒng)。
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基質(zhì) | 硅膠 |
官能團 | 二醇基 |
粒徑 | 2μm |
孔徑 | 12.5nm |
分子量排阻限 | 500 kDa |
分離范圍 | 5-100 kDa |
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在寡核苷酸的分析中,尺寸排阻分離模式是基于堿基數(shù)量、磷酸基不同導(dǎo)致的分子量差別進行分離,通常用于簡單的質(zhì)量控制或純度研究。?
下圖是采用兩根串聯(lián)的SEC色譜柱TSKgel UP-SW2000來區(qū)分長度相差一個堿基的寡核苷酸混合物 (20-mer和N-1 19-mer)。
色譜條件:
色譜柱:TSKgel UP-SW2000(2μm,4.6×300mm×2)
流動相:50mmol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 6.7)
?????300mmol/L NaCl,0.03%?NaN3
流速:0.2 ml/min
檢測:UV260nm
樣品:19-mer and 20-mer
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