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第161期--東曹色譜柱在寡核苷酸分析中的應(yīng)用

2023年05月06日來源:管理員
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寡核苷酸是合成的短鏈DNARNA分子,可用于治療,通過與目標基因或蛋白序列結(jié)合來阻礙基因表達或蛋白發(fā)揮作用??焖僭鲩L的寡核苷酸療法市場包括靶向性非常強的反義DNA和小干擾RNA (siRNA),在治療癌癥、遺傳病和其他疾病方面有著廣泛的應(yīng)用前景。

液相色譜技術(shù)具有分離效率高、選擇性好、檢測靈敏度高、應(yīng)用范圍廣等特點,已成為核酸藥物生產(chǎn)與質(zhì)控分析必不可少的重要手段。本期內(nèi)容將介紹TSKgel色譜柱在寡核苷酸分析中的應(yīng)用。

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治療性寡核苷酸分離色譜模式如下圖:

111.png


一、離子交換色譜柱

TSKgel DNA-NPR陰離子交換色譜柱性能參數(shù)。

基質(zhì)

聚甲基丙烯酸酯

粒徑

2.5μm

孔徑

無孔

官能團

獨有

抗衡離子

ClO4-

pH耐受范圍

2.0-12.0

蛋白容量

5g BSA/L

離子交換容量

0.1eq/L

pKa

11.2

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下圖是TSKgel DNA-NPR陰離子交換色譜柱對13個堿基的硫代磷酸寡核苷酸粗樣分析的色譜圖。

222.png

色譜條件:

色譜柱:TSKgel DNA-NPR4.6×75mm

流動相:A20mmol/L NaOHpH 12+10mmol/L NaBr+1%二乙胺

????B20mmol/L NaOHpH 12+1mol/L NaBr+1%二乙胺

梯度:3.5min20%B),12min20%B),45min55%B

流速:1.0ml/min

檢測:UV260nm

溫度:60

樣品:粗合成寡核苷酸(13mer,脫保護)

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一、尺寸排阻色譜柱

硅膠基質(zhì)填料表面鍵合二醇基,粒徑2μm,適用于小分子蛋白、多肽、寡核苷酸等生物分子的快速、高分辨率分析??杉嫒?/span>UHPLC系統(tǒng)與常規(guī)HPLC系統(tǒng)。

?

基質(zhì)

硅膠

官能團

二醇基

粒徑

2μm

孔徑

12.5nm

分子量排阻限

500 kDa

分離范圍

5-100 kDa

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在寡核苷酸的分析中,尺寸排阻分離模式是基于堿基數(shù)量、磷酸基不同導(dǎo)致的分子量差別進行分離,通常用于簡單的質(zhì)量控制或純度研究。?

下圖是采用兩根串聯(lián)的SEC色譜柱TSKgel UP-SW2000來區(qū)分長度相差一個堿基的寡核苷酸混合物 (20-merN-1 19-mer)。

333.png

色譜條件:

色譜柱:TSKgel UP-SW20002μm,4.6×300mm×2

流動相:50mmol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 6.7

?????300mmol/L NaCl,0.03%?NaN3

流速:0.2 ml/min

檢測:UV260nm

樣品:19-mer and 20-mer

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