前處理
凝膠分離模式主要是靠分子量大小差異來達到分離的目的，前處理就顯得尤為重要。主要方式為對樣品進行離心和過濾，離心可以除去大部分塊狀物，再用針式濾器進行過濾即可。
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溶液交換量
控制上樣體積，以不超過柱床體積30％為宜；
關注樣品溶液體積濃度，可以分多次上樣，注意每次上樣時間間隔，可根據電導色譜峰確定下一次上樣時間。
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提高分辨率
1.保證填料裝填勻實；
2.增加柱床高度；
3.控制上樣體積，以不超過柱床體積5％為宜；
4.關注樣品黏度和取代溶液黏度是否保持一致；
5.根據樣品特點選擇更優(yōu)的取代溶液，優(yōu)化取代溶液的離子強度和親水性；
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優(yōu)化對稱性
1.保證填料裝填勻實，拖尾→填料較松丨適當增加裝柱壓力，前沿反之；
2.使用太久柱料臟了→填料再生。
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出現肩峰
1.柱床：重新裝柱或反沖；
2.篩板：超聲清洗篩板；
前處理
凝膠分離模式主要是靠分子量大小差異來達到分離的目的，前處理就顯得尤為重要。主要方式為對樣品進行離心和過濾，離心可以除去大部分塊狀物，再用針式濾器進行過濾即可。
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溶液交換量
控制上樣體積，以不超過柱床體積30％為宜；
關注樣品溶液體積濃度，可以分多次上樣，注意每次上樣時間間隔，可根據電導色譜峰確定下一次上樣時間。
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提高分辨率
1.保證填料裝填勻實；
2.增加柱床高度；
3.控制上樣體積，以不超過柱床體積5％為宜；
4.關注樣品黏度和取代溶液黏度是否保持一致；
5.根據樣品特點選擇更優(yōu)的取代溶液，優(yōu)化取代溶液的離子強度和親水性；
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優(yōu)化對稱性
1.保證填料裝填勻實，拖尾→填料較松丨適當增加裝柱壓力，前沿反之；
2.使用太久柱料臟了→填料再生。
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出現肩峰
1.柱床：重新裝柱或反沖；
2.篩板：超聲清洗篩板；
蛋白質和親和介質不結合
1.?標簽未翻譯或標簽被包裹在結構內
需要檢查質粒序列或將標簽移到其他位置，標簽移到其它位置仍被包裹在結構內部時，就要將標簽暴露出來
2.?優(yōu)化結合緩沖液及充分平衡層析柱
調整緩沖液（如金屬鰲合介質和His標簽蛋白結合時pH應在7.3-8.5之間，在如肝素親和介質和DNA聚合酶結合時鹽濃度太高影響結合，應控制在50mM以下）。
層析柱沒平衡好，柱床體系中的環(huán)境如pH，離子強度也會影響結合，層析上樣前要充分平衡層析柱。
3.?增加結合時間
降低上樣流速讓蛋白和介質有充分的接觸時間。
4.?更換更優(yōu)層析介質
親和介質分類，一類是特異性結合一種蛋白，另一類是特異性結合一類蛋白。（如蛋白a介質結合一種蛋白，而肝素個質結合一類蛋白。所以選擇的時候我們一定要了解其原理。）
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蛋白結合在柱子未洗脫出
1.?蛋白和介質結合力過強
增加洗脫強度（his蛋白和鎳柱結合，可以增加取代基咪唑的濃度）。
2.?蛋白聚集在層析柱上
通過調整層析過程的緩沖液增加蛋白的穩(wěn)定性，改善蛋白在層析柱上的狀態(tài)。
聚集在層析柱上時就要對層析柱進行CIP清洗。
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低分辨率（洗脫后純度低）
1.層析過程流速的影響
調整層析過程的流速，流速影響蛋白質和介質的親和力，層析時要選擇合適的流速。
2.柱床未充分淋洗
上樣后，要對柱床進行充分的淋洗，將未和介質結合的留在介質顆粒間隙，孔內的蛋白洗出來，再洗脫。
3.蛋白之間的非特性結合
優(yōu)化體系緩沖液（比如加入10%的甘油等減少蛋白之間的非特異性結合）。
4.介質的非特異性結合
優(yōu)化緩沖液，減少層析過程的非特異性結合（如His蛋白用金屬鰲合填料純化時，可以在緩沖液中加入300mM的氯化鈉，減少蛋白和介質的非特異性結合）。
5.洗脫過程的影響
如肝素柱子洗脫過程中拉合適的鹽梯度可以提高特異性，His標簽蛋白和金屬鰲合介質結合后，洗脫時拉咪唑梯度可以提高純度。
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蛋白質純化過程中失活
1.蛋白去折疊或聚集
優(yōu)化緩沖液使其利于蛋白質保持穩(wěn)定。蛋白質在介質上的高密度下容易聚集可以添加一些蛋白的增溶劑等。
2.純化過程中保持蛋白的活性的輔助因子被法除
如一些酶類的活性需要金屬離子輔助其活性，在純化過程中就要添加蛋白的活性輔助因子。
